實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time pcr，rt-pcr）是一種高效、靈敏且廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的技術(shù)。它結(jié)合了傳統(tǒng)pcr技術(shù)和熒光探針的使用，使我們能夠?qū)崟r監(jiān)測pcr反應(yīng)過程中目標(biāo)dna或rna的擴增量，從而可以準(zhǔn)確快速地定量分析樣本中的特定分子。
rt-pcr的工作原理非常簡單，它包括三個主要步驟：逆轉(zhuǎn)錄、pcr擴增和熒光檢測。
首先，通過逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的作用，將rna逆轉(zhuǎn)錄成其對應(yīng)的cdna（復(fù)制的dna）。這一步允許我們將rna樣本轉(zhuǎn)化為dna，從而方便后續(xù)的pcr擴增分析。
接下來，將逆轉(zhuǎn)錄后得到的cdna用作pcr的模板。通過加入特定的引物（primers）和熒光探針（例如taqman探針或sybr green探針），我們可以選擇性地擴增和檢測感興趣的目標(biāo)序列。
在pcr反應(yīng)過程中，熒光探針與pcr產(chǎn)物結(jié)合，并釋放出熒光信號，這個信號的強度與目標(biāo)序列的起始數(shù)量成正比。利用實時pcr儀器，我們可以實時監(jiān)測這些熒光信號的累積，從而獲得pcr反應(yīng)的實時擴增曲線。通過分析擴增曲線，我們可以確定樣本中目標(biāo)分子的起始數(shù)量，并進(jìn)一步比較不同樣本之間的相對表達(dá)水平。
rt-pcr在許多研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用：
基因表達(dá)分析：rt-pcr可用于研究基因在不同組織、細(xì)胞類型或治療條件下的表達(dá)水平。這有助于了解基因在生理和病理過程中的功能和調(diào)控機制。
病毒檢測：rt-pcr是許多病毒檢測的主要方法，包括感病毒、hiv等。它可以快速、準(zhǔn)確地檢測病毒的存在，并用于臨床診斷和流行病學(xué)研究。
微生物學(xué)研究：rt-pcr可用于檢測和定量微生物的存在，例如細(xì)菌、真菌和寄生蟲等。這對于了解微生物的種類和數(shù)量在感染和疾病中的作用至關(guān)重要。
癌癥診斷：rt-pcr在癌癥診斷中也有廣泛應(yīng)用。通過檢測腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平，可以幫助早期發(fā)現(xiàn)癌癥并監(jiān)測治療效果。
總結(jié)起來，實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（rt-pcr）是一種高效、靈敏且廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。它在基因表達(dá)分析、病毒檢測、微生物學(xué)研究和癌癥診斷等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，rt-pcr在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中將繼續(xù)扮演關(guān)鍵的角色，并為科學(xué)家們提供強大的工具來深入研究和理解生命的奧秘。
在進(jìn)行分子實驗前，需要對實驗環(huán)境進(jìn)行清潔。在pcr實驗室中，dna污染很難清除。即使只有一個污染的dna分子被檢測到，也會使整個pcr檢測過程出現(xiàn)誤差。為確保pcr試驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，預(yù)防dna或rna交叉污染，pcr實驗室大多會常備dna/rna污染清除劑。
祛除dna污染噴霧劑（實驗環(huán)境用）——pcr-clean，可有效地降解大多數(shù)表面上（輕質(zhì)金屬或有色金屬除外）的擴增子，質(zhì)?；蚧蚪Mdna和rna。該產(chǎn)品還能有效地去除dna酶和rna酶。