專業(yè)的rt-pcr實驗代測服務商
服務內容：
1.制定個性化實驗方案：根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內參；2.檢測類別：mrna、mirna、lncrna、dna；3.樣本抽提及質檢：對客戶提供樣本進行rna抽提，并利用nanodrop進行樣本質檢；4.定量pcr預實驗：包括樣本反轉錄為cdna、配置pcr反應體系及進行real-timepcr反應；5.正式定量pcr實驗：根據預實驗結果進行正式實驗；6.數據分析：采用2- △△ct法進行分析，比較不同樣本間差異。
服務要求：1.請?zhí)峁┙M織樣本，細胞樣本，血漿或血清樣本，totalrna；2.請?zhí)峁┮阎娜L基因序列或genebank號；3.請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：dna/rna來源、基因豐度等。
結果內容：整理好的報告，樣本收到之日起5個工作日內反饋質檢結果。
結果展示：
樣本質檢圖
溶解曲線：
擴增曲線
數據統計
每個指標有2張圖。一張是擴增曲線，另一張是熔解曲線，用來證明pcr擴增中無非特異性擴增
送樣運輸要求：
1. 樣品處理
a. 動物組織：常規(guī)組織，脂肪組織，結締組織，纖維化組織適當增加。將組織剪切成合適大小后（建議組織塊長寬高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍體積的rnasolidtm試劑中。（注意：已浸入rnasolidtm試劑中的組織經平衡一段時間后，可從溶液中取出，切成更小的組織塊，再重新放回rnasolidtm試劑中；有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等，不適合用rnasolidtm試劑進行rna保護。）
b.植物組織：新鮮的葉、果肉、種子最少100 mg。將嫩葉，嫩莖組織切成合適的大?。ńㄗh長寬高均不大于0.5 cm）后，然后迅速浸泡于5～10倍體積的rnasolidtm試劑中。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表面的蠟層可阻礙rnasolidtm試劑的滲透，對于此類組織，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）
c.細胞等樣本：收集不小于10^6個細胞的沉淀（用pbs清洗1-2次）。之后迅速加入5～10倍體積的rnasolidtm試劑。
d.酵母、細菌等樣本：離心棄上清，收集小米粒大小的單菌體沉淀，然后迅速加入適量的rnasolidtm試劑浸沒菌體沉淀。
e. rna樣品： od260/280為1.8-2.0，濃度≥100 ng/μl，體積≥20μl，干冰運輸。
f.cdna：cdna原液≥20 μl，干冰運輸。
2. 樣品保存及運輸
加入有rnasolidtm試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的rna會開始降解。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周，不會有明顯的rna降解發(fā)生。大部分樣品置于rnasolidtm試劑中，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個月，不會有明顯的rna降解發(fā)生。長期存放可先將保存在rnasolidtm試劑中的樣本4℃浸透過夜，然后將rnasolidtm試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩(wěn)定保存3～5年。
關于real-time qpcr如何進行數據分析
1. real-time qpcr常見參數
基線（baseline）
通常是3-15個循環(huán)的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
ct值:與起始濃度的對數成線性關系。
分析定量時候一般取ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
rn（normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值?！鱮n：△rn是rn扣除基線后得到的標準化結果（△rn=rn-基線）。
2. 影響ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使ct在15-35之間
反應液成分的影響
任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的ph值和鹽濃度。
pcr反應的效率
pcr反應的效率也會影響ct值。在pcr擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯度稀釋擴增，與pcr擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。pcr效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量pcr反應的效果
pcr擴增效率：為了正確地評估pcr擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。
另一個評估pcr效率的關鍵參數是相關系數r2，它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果r2等于1，那么你可以用y值（ct）來準確預測x值（量）。如果r2等于0，你就不能通過y值來預測x值。r2值大于0.99 時，兩個數值之間相關的可信度很好。
標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。
如果許多數據點都靠近平均值，那么標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態(tài)分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果pcr反應效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均ct間隔應該恰為1個ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小于等于 0.250
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